细菌基因组DNA提取试剂盒

产品货号：

WH0028

中文名称：

细菌基因组DNA提取试剂盒

英文名称：

Extraction kit for genomic DNA from bacteria

产品规格：

50次

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1～3天

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本试剂盒采用可以高效、专一结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，既适用于革兰氏阴性菌基因组DNA的提取，也可适用于革兰氏阳性菌基因组DNA的提取。本试剂盒也可用于食品致病菌（微生物)基因组提取，如：金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、出血性大肠杆菌O157：H7、单增李斯特、沙门氏菌、阪崎肠肝菌等。可从1～5mL细菌培养液中，快速提取纯化10～40μg纯净的基因组DNA，所得基因组DNA可直接用作PCR模板、酶切、杂交等分子生物学实验。

简单快速：革兰氏阴性菌在1h内可获得高纯的基因组DNA。
质量好：DNA可直接用于PCR、酶切、杂交等分子生物学实验。

细菌类型	革兰氏阴性	革兰氏阳性
细菌浓度	2×10⁸cells/ml	3.5×10⁸cells/ml
培养液体积	1mL	1mL
DNA得量	15～20μg	6～13μg
OD₂₆₀/OD₂₈₀	1.7～1.9	1.7～1.9

注：细菌种类、培养时间不同提取的DNA量会有差异；革兰氏阳性菌需要使用溶菌酶进溶菌等特殊处理后，再按革兰氏阴性菌的操作步骤进行基因组DNA的提取。

产品组成

组分	规格
缓冲液GA	15mL
缓冲液GB	15mL
缓冲液GD	13mL
漂洗液PW	15mL
洗脱缓冲液TE	15mL
Proteinase K	1mL
吸附柱CB3	50个
收集管（2mL）	50个

保存条件：室温（15～25℃）干燥条件下，可保存12个月，更长时间的保存可置于2～8℃。2～8℃保存条件下，若溶液产生沉淀，使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时间，必要时可在37℃水浴中预热10min，以溶解沉淀。

自备试剂

溶菌酶（革兰氏阳性菌)、无水乙醇、溶菌酶缓冲液（20mM Tris,pH8.0;2mM Na2-EDTA;1.2%Triton-100)

注意事项

样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量也下降。
若缓冲液GA或GB中有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，并摇匀后使用。
所有的离心步骤均为使用台式离心机，室温下离心。

使用前请先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。

取细菌培养液1～5mL，10000rpm（~11500×g)离心1min，尽量吸净上清。
向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。
注意：对于较难破壁的革兰氏阳性菌，可略过第2步骤，加入溶菌酶进行破壁处理，具体方法为：加入180μL缓冲液（20mM Tris,pH8.0；2mM Na2-EDTA；1.2% Triton；终浓度为20mg/mL的溶菌酶（溶菌酶必须用溶菌酶干粉溶解在缓冲液中进行配制，否则会导致溶菌酶无活性))，37℃处理30min以上。
如果需要去除RNA，可加入4μL RNase A（100mg/mL）溶液（客户自备，目录号：WH0217），振荡15sec，室温放置5min。
向管中加入20μL Proteinase K溶液，混匀。
加入220μL缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。
加220μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm （~13400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400×g)离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。
重复操作步骤8。
将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm（~13400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。
将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min，12000rpm （~13400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH2O做洗脱液应保证其pH值在7.0～8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000rpm（~13400×g)离心2min。

DNA浓度及纯度检测：

得到的基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
DNA应在OD₂₆₀处有显著吸收峰，OD₂₆₀值为1相当于大约50μg/mL双链DNA、40μg/mL单链DNA。
OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7～1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用ddH2O，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。

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